北京高通量测序分析方法

哈喽，大家好，欢迎来到组学大雁塔，我是欧姆斯金，那么从这刻开始呢，由我来给大家讲解微生物多样性数据分析实操这门课程，那么主要针对的数据呢，就是十六 s， its 十八 s 啊，测序得到的高通量测序的数据。 那么学习之前呢，我们首先来简单的了解一下微生物多样性数据分析的一个原理，还有一些内容。 那么环境微生物多样性分析呢，就是分析环境中微生物群落的一个群落结构， 那么包括微生物的种类，风度啊等等信息，那环境中的微生物呢，可以说是无处不在，所以说任何环境呢，都可以取样研究一下环境中微生物的一个菌群结构， 你比如说自然环境中微生物多样性的一个分析啊，比如说空气啊，水啊，还有土壤啊，都可以去研究一下它的一个菌群结构。 那么再比如和人类相关的一些环境也可以去研究一下，比如说人居住的环境，还有人体自身的一个环境，那么人体自身的一个环境呢，包括哎，口腔环境，还有这个肠道微生物环境， 另外呢还有生物能源，还有医药相关的一些微生物环境的研究啊等等。那么环境微生物研究有什么重要的意义呢？这里呢举一个例子，现在呢人体肠道微生物的研究呢，十分的火热啊，已经有很多研究报道人体肠 道微生物呢，和我们人体的一个健康的息息相关，甚至有人提出人体肠道微生物呢是人体的第二套基因组及人体的一个黄金组，那么即带我们去探索挖掘里面蕴含的奥秘。 近年来呢，环境微生物多样性的一个研究呢，越来越受到人们的重视，那么其研究成果呢，频繁发表在生命科学领域顶级的期刊上，并被选为这个封面文章 啊，例如这个 nature 啊， style 啊等等。那逐渐环境微生物研究的一个重要性， 那环境中微生物多样性的研究呢？主要分为原核生物和真核生物，那么原核生物呢，主要是指这个细菌，那么真核生物呢，主要 是指真菌。那随着高通量测序技术的发展，研究环境中微生物主要通过测序环境中的核桃体 rna 金进行研究， 那么这主要是因为核导体 rna 基因的一个保守性啊，也就是种类保守总监呢 存在差异。那么我们在测环境中的核钢铁 rna 基因的时候呢，我们就可以认为相同的核钢体 rna 基因呢，来自于同一种微生物，那不同的序列呢？来自不同种的微生物，那么序列的数量呢，就代表了环境中微生物的一个风度。 那这里呢简单了解一下生物钟的一个核当体的组成，那上面这个呢就是原核生物的核当体的组成， 那么下面这个呢就是啊真核生物的核糖体的组成，那么原核生物的核糖体组成呢，主要包括这个二三 srng， 五 srng， 还有十六 srng， 组成这个大哑剂还有小哑剂，那其中呢还有一些蛋白啊，最后呢 组成一个核囊体，那么下面这个呢，就是真核生物的核囊体的一个组成，我包括二十八 srma， 还有这个五点八 s， 还有五 s， 还有十八 s 以及一些蛋白 制，然后呢组成大小哑迹，最后呢形成一个完整的一个核当体啊，这里呢就是核当体这个结构呢啊，大家了解一下，重点呢了解一下这个核当体的不同的啊，不同成浆系数啊，这个 s 呢就是不同的成浆系 技术的一个 r m a g 对不对？好，这里呢重点介绍一下细菌当中的十六 s 测序，由于细菌中的十六 s r m a g 呢，它的长度适中啊，并且呢有可变区和保守区的一个特点，所以细菌中 研究微生物呢，一般选择十六 s r n a 基因呢进行测序研究，那么这里呢就是细菌中十六 s r n a 基因的一个序列，特点包括十个啊，保守句，这个白色的部分呢就是保守句，这个蓝色的部分呢就是高可变句， 总共呢有九个，那么我们可以在保守区呢设计通用引物，把环境中所有的细菌呢给扩增出来，那这里呢常见的引物呢也给大家标了一下 下啊，那么带 f 呢就是 forward primer， 那么 r 呢就是 reverse primer， 然后呢大家可以根据自己的研究的目的呢，去选择合适的引入呢，去扩增啊特定的区域呢，去做后续的一个测序分析。 那么由于高通量测序技术多长的一个限制呢，我们一般选择这个 v 三加 v 四区进行测区啊，也可选择单侧微次区啊，也是可以的。 那具体选择哪个区域进行测训呢？大家尽可能去参考一下同行发表的一些文章呢，进行一个参考啊。 那么真核微生物的研究呢，主要是真菌微生物的研究，那么真菌微生物的研究选择的呃测序的一个对象呢，就是这个 ids， 也就是啊内爪鹿腱 间隔区啊，呃，就是这个十八 s， 五点八 s， 还有二十八 s 之间的这个序列啊，那么这个序列呢不是基因啊，所以说它呢具有高可变性啊，高可变性。 那么这三个呃核糖体 r n a 基因呢，分隔了两个区域啊，第一个区呢叫 i t s 一，第二个区呢叫 i t s two， 那么通常呢我们会选择 i t s one 进行一个测序哈， 那么这里呢就是微生物多样性分析的一个主要步骤，那左边呢都是一些实实验啊，右边呢就是我们的一个生物性医学数据分析，那左边呢第一步呢就是环境中去取量，然后呢提取环境中的， 因为然后提取完之后呢，我们就加入特定的一个测序引物，哎，就是扩增子测序，那个设计的那个保守区设计的一个引物加进去，然后进行扩增，扩增出一些 片段啊，这些片段，那么这些片段呢就是啊微生物的一个核糖铁 rna 金啊，如果是这个细菌的话就是核糖铁 rna 金，如果是真菌的，一般是 ats 的一些片段，那么这个时候呢，微生物多元性的一个分析呢，也叫扩增子 啊，测序分析，那么扩张完之后呢，我们就可以去上机啊，然后呢进行一个测序，测完序之后呢，我们就进行一个数据分析，那么测完序之后呢，我们就得到了一个数据，那么这个数据呢，可以做一些前期的处理啊，比如说一些直空啊 啊，数据处理啊，还有就是去除一些影物啊，把口啊等等一些啊，数据的处理之后呢，我们就可以得到一个 clean 的 deta， 那有了 clean deta， 我们就可以据类生成 oto， 然后呢进行数据库的一个注视，然后去分析这个 呃，样本当中的阿尔法贝塔，端信啊等等一系列的一个数据分析。好，这里呢总结一下微生物端阳性分析的一个主要内容哈， 这里呢微生物多样性数据分析的一个主要内容呢，主要包括啊三大部分啊，首先第一个呢就是原属数据到 oto 表， 这个是一个基础的分析，那么以后的数据分析呢，基本上都是围绕这个 o t o table 啊进行分析。第二种呢就第二个大的内容呢，就是啊，微生物的一个多样性 性分析，对不对物种的多样性分析。最后呢就是一些高级的分析，那么这里呢字有点小，我们啊再放大了看一下。首先第一个呢就是原数数据到这个 oto table， 我这个呢是所有数据分析的一个基础啊，就是这个 oto table 啊，非常的重要，那么主要包括比如说我们高端量测序呢，数据呢一般都是双端测序，然后呢 我们需要对数据进行合并，合并完之后我们会去除一些啊，剧烈上的一些啊，不必要的 数据啊，比如说测序的时候啊，由于样品的混合，加入了就是八扣的信息，还有就是引物序列啊，都可以去去掉。第二个呢，再去除一下嵌合体啊，由于 pcl 扩增啊，很有 可能就是产生这个嵌合体啊，所以说我们需要把它给去除掉，然后呢我们那么去除完嵌合体之后呢，我们就得到了一个 clean bate， 然后呢我们就可以剧类生成 otu， 生成 otu 之后我们可以根据啊数据库，然后对 otu 呢进行一个物种的注视， 注册完之后呢我们可能啊可能有些 o t u 呢就是特别的稀有啊，可能是一些错与错啊，我们会把一些稀有的 o t u 呢给过滤掉，呃，最后呢就是一些啊数据的一个标准化啊，标准化 第二大部分呢就是啊啊微生物多样性分析的一个重要的内容啊，就是物种多样性的分析，那么物种多样性的分析呢，分为物种风度还有组成的一个展示，还有就是 alpha 多样性，还有这个北塔多样性啊， 那后续呢，我会详细的啊，在分析过数据的过程当中呢，再给大家详细的展开讲解啊啊，最后呢就是一些高级的分析啊啊昆仑子数据分析呢，也可以预测一下这个功能， 然后也可以做一下这个机器学习，那么机器学习呢，可以对我们的数据呢进行一个啊分类或者是回归预测 啊，还有一个呢就是系统发油数分析，还有一个呢就是环境因子分析，最后呢可以分析一下菌群的共同网络分析。 好，那么我们这个微生物多样性分析的一个原理，还有这个内容啊，讲解的比较简单，那么大家如果想 详细的了解一下啊微生物啊，十六 s i t s 十八 s 分析这个原理啊，以及它的一个结果是怎么解读的话，建议大家呢可以去看一下这门课程啊，大家可以扫描二维码或者是点击这个链接呢就可以去啊学习一下。好， 那么这里呢我们来重点呢介绍一下我们这个课程的一些特色哈，那么首先呢我们要分析这个数据啊， 那么分析数据呢，我们啊主角大脑上提供了一个多壳镜像，那么这个多壳镜像里面安装了所有的关于扩增子数据分析的所有的软件，大家呢就不需要去自己呢 啊安装额外的软件啊，方便大家呢进行数据分析，那么大家只要安装一个软件就可以啊，那么安装 装的软件呢就是这个多克，那么这个多克呢可以在啊 linux 啊，可以在苹果系统，还有可以在 windows 系统当中都可以安装，还有也就是说大家啊只要手里有一台电脑，然后呢安装了系统啊，都可以去安装上多克，然后都可以去分析我们的这个 啊扩增组数据分析哈，那么我们一旦安装了 doctor 啊，进入那个虚拟机之后呢 啊，大家的操作呢，就可以跟我上课老师的操作呢就可以完全一样啊，避免一些由于环境的啊 变量啊，由于环境软件安装的一些问题呢，导致一些必要的错误啊，方便学员呢啊进行学习啊，那么还有个呢就是我们这个课程呢，不仅仅说就是大家呢就是跑跑 那个 team 或者是由四二七那个流程啊，那么重点呢就是说大家跑那些流程呢，都可以跑出来，但是呢结果的展示呢，也是一个非常重要的内容，也就是说大家分析完数据，如果 没有进行一个很好的展示的话啊，你再好的结果呢，也无法发文章，对不对？所以说我们这门课程呢，也是写了很多的脚本，教大家如何去啊展示自己的结果，你比如说这个画热图啊，画这种 柱状图，还有这个做 left 分析，还有这个 s t n m p， 还有这个三元像度，还有这个物种和样本之间的一个啊组成的圈图，还有这个 colono 图，还有这个维音图，那么维音图呢，也可以这个 upset 类型，还有这个花瓣图， 还有这个 box 图啊，等等啊，那么我这里呢只是贴了一部分啊，就是大家需要我这门课程之后呢，就可以利用我们课程当中的一些脚本命令，然后完成 啊数据的一个分析，还有这个可视化的展示，那么最终呢，就是这个图片的一个输出呢， 我们课程当中输出的图片呢，几乎就是可以直接的啊，用于文章的一个发表啊，非常的呃，好用啊， 好，那么这节课就到这里啊，谢谢大家。

第二代测，又称为高通量测序，是基于 pcr 和基因芯片发展而来的 dna 测序技术。我们都知道一代测序为合成终止测序， 而二代测序开创性的引入了可逆终止末端，从而实现边合成边测序。二代测序在 dna 复制过程中，通过捕捉新添加的剪辑所携带的特殊标记，一般为荧光分子标记来确定 dna 的序列。由于在二代测序中， 单个 dna 分子必须扩增成由相同 dna 组成的基因促，然后进行同步复制 来增强荧光信号强度，从而读出 dna 序列。而随着读长增长，基因促复制的协同性降低，导致剪辑测序质量下降，这严格限制了二代 测序的读长，因此二代测序具有通量高、读长短的特点。二代测序适合扩增子测序，而基因组、红基因组 dna 则需要使用鸟枪法打断成小片段，测序完毕后再使用生物信息学方法进行拼接 文库构建，即为测序片段添加接头。无论是 pcr 产生的片段还是基因组鸟枪法打断的片段都具有特异性。 pcr 中不同样品反向引物插入了特异性的 barcode， 因此两端也是特意的，两端缺乏必要的引物，因此混合 dna 片段不能直接扩增和测序。 dna 片段需要加接头修饰才能进行上机测序，这个过程称为二代测序的文库构建、末端修饰。目前很 很多 pcr 使用的高保真聚合酶产生的片段末端是平齐的，鸟枪法产生的片段则是随机断裂，其末端可能是平齐的，也可能是不平的。因此建固第一步是使用 tact 聚合酶补齐不平的末端，并在两个末端添加突出的剪辑 a， 从而产生粘性末端。产生粘性末端的片段可以添加接头。添加接头经过末端修饰后的 pcr 片段末端具有突出的 a 位，而接头具有突出的 t 位。 可以使用连接酶将接头添加到 dna 片段两端，接头为特殊的剪辑 you 连接的环状结构，因此连接接头后还需要将剪辑 you 删除，从而形成外形接头。这一步添加的接头主要 是为了后续 pcr 中作为影物扩增继续添加文库 index 和与测序平台互补的寡核苷酸序列。而之所以为 y 形开叉结构，是因为每一端接头是两条不互补的序列，因为连接酶没有选择性， 每个接头都是只靠突出的 t 来与 dna 连接。外接头保证了每条单序列两端均为不同的测序引物，从而在后续 pcr 中可以连接不同的寡核苷酸序列。 瓷珠淳化是添加接头后的文库体系中含有聚合酶、民间酶等各种酶以及辅助物质，接头的添加也是过量的，而且由于末端的不稳定性，容易形成自联片段，鸟枪法打断的片段中也可能有大片段存在，所以需要 特殊磁珠重化来去除大片段以及各种杂质，从而获得成功添加接头的文库片段。其原理为磁珠可以通过清溅等作用力来吸附 dna 片段，磁珠本身不具有片段大小选择的能力， 因此瓷珠纯化的时候要根据文库片段不同严格控制瓷珠添加量来实现片段选择。 pcr 扩增添加了接头的 dna 片段可以使用与接头互补的影物来扩增， 这个过程非常重要，因为目前所有片段其两端是不互补的 y 形结构，不能直接进行测序。 此外，片段还需要添加用于区分不同文库的特异性 index， 以及与测序仪芯片互补的两种寡核苷酸序列。测序是以单链为单位的， 建库完成后的每条 dna 的单列均一端连有测序引物 read in sequencing primer、 road esp 和 p 五，另一端回 road r sp index sparkle 的和 p 七。 index 用来区分不同的文库，因为测序仪一个 run 产生数据量巨大，由于实际情况不同， 一次上机常会进行多个文库测序，因此需要加上 index 来区分。在建库过程中，文库中每个 dna 短片段的正链与反链都加上了 p 五与 p 七，因此建库后每个 dna 片段都会扩增出两种结果。 如果全部上机，最终两条链都会有测序结果，因为上机测序其实是以 dna 单链为单位，单链化的 dna 片段 进入测序仪流通池会随机的结合在不同位置，且相互距离足够远，以保证测序信号的独立读取。最终获得的测序结果会有重复的 raise， 所以都会有区重步骤，而且测序量越大，重复率会越高。

如何解析人类多样性的遗传密码？当一种新的传播性极强的疾病蔓延时，我们又该如何快速的找到病原体？如何精准预防、诊断和治疗？ 那么什么是高通量测序呢？ 大家好，我是来自中山大学肿瘤防治中心 的博士生陈西西，今天我科普的主题是高通量测序技术的应用。 相信大家都听过这样的一句话，世界上没有两片完全相同的树叶，同样的，世界上也没有两个完全一样的人。但是为什么人类有这样的多样性？ 人类的多样性由什么决定？如何解析人类多样性的遗传密码？ 当一种新的传播性极强的疾病蔓延时，我们又该如何快速的找到病原体？如何精准预防、诊断和治疗？ 别急，这些问题都可以通过高通量测序来解决。 那么什么是高通量测序呢？所谓高通量测序，就是一次性、大规模的对几百万到几亿条 dna 分子同时进行序列测定， 高效快速的在两到三天之内对一个物种的全部核酸序列进行全面、深入、细致的分析。 与传统的一代测试相比，速度更快、更灵敏，成本更低，目前在临床上已经被广泛应用。 那么如何对核酸序列进行测定呢？我们需要先复习一下中学生物的基础知识。我们都知道，细胞是人类 类生命结构和功能的基本单位， dna 是人类的遗传物质，由双螺旋结构组成，其中四种剪辑 atcg 的排列顺序决定了遗传信息， 对核酸序列测定就是明确剪辑的排列顺序。接下来我们来看看具体的工作流程吧。首先根据临床需要进行患者评估，并且收集患者样本，然后将患者样本处理成可以测序的片段， 利用测序仪测序，最后进行结果分析。首先是样本收集和处理，我们通常会收集患者的组织样本和外周穴 等体液，然后进行核酸提取纯化。将提取纯化好的 dna 长链进行人工打断， 打断成大概两百个剪辑左右的 dna 短链。然后这些短的序列被加上了不同的标签，方便与后续 pcr 扩增和唯一识别，这样就形成了 dna 测序文库。 接着这些 dna 文库被加入到已经制备好的基因芯片上，芯片上也有一些特定的序列可以和这些 dna 结合， 随后启动 p、 c、 r 扩增反应。在合成大量 dna 片段的过程中，每增加一个不同类型的剪辑，就会发 出一次不同颜色的荧光。由于 dna 合成过程中用到四种剪辑，就带有四种不同颜色的荧光，通过荧光颜色可以识别具体的剪辑类型。测序仪器可以对这个过程进行拍照，记录下来荧光颜色。 最后将这些剪辑的顺序读出来，根据前面加上的标签，把片段拼接在一起，就能得到完整的 dna 序列。 目前高通量测序技术已经广泛应用于临床，比如风险人群的早期预防、疾病分期诊断以及个体化用药。比如我们发现孕妇妈妈体内外周血中 有宝宝的 dna 片段，那么通过对妈妈外周穴进行高通量测序，就可以得到宝宝的遗传信息，可以筛查二十一、染色体综合症等染色体遗传疾病，避免了传统的羊水穿刺操作等带来的风险。 另一个例子是曾经在二零幺三年登上纽约时报的好莱坞著名演员安吉丽娜朱莉。由于妈妈和姨妈先后由于癌症去世，他进行了全基因组测序，发现携带 brocco one 基因突变， 有百分之八十七患乳腺癌和百分之五十患卵巢癌的风险。于是他做了一个大胆的决定，在二零幺三年预防性切除了双侧乳腺， 二零幺五年也预防性切除了双侧卵巢，避免癌症发病风险。 我们课题组也组织国内以及国际多中心开展研究，利用高通量测序进行了一些工作，揭示了 e b 病毒相关的 dna 和淋巴瘤的治病机制，发现了新的预感基因和遗传未点， 有助于早期高危患者的筛查。相关成果发表于以下国际高影响力的期刊。 高通量测序也广泛应用于肿瘤靶向药物选择，比如检测肺癌患者的基因突变类型。肺腺癌患者可能拥有 kras、 e、 g、 f、 r 等多种基因突变。通过对患者样本进行高通量 量测序，可以提示选择特定的靶向药物进行精准治疗。 高通量测序技术也用于患者疗效预测，比如用于评估患者的肿瘤突变复合，也就是百每百万碱基中被检测出的基因突变数量。 图中的纵坐标代表肿瘤突变复合。肺癌患者接受 p d one 免疫治疗以后，高肿瘤突变复合的患者对免疫治疗响应更强，无进展，生存期更长，愈后更好。 最后，精准治疗的早日实现离不开大数据和高通量测序，当然也离不开我们大家未来一起的努力和探索，谢谢大家。

这时课程我们来介绍一下小 r a 的分析。小 r a 属于一类非编码 r a。 小 r a 称为 micro r a， 简称 m i。 r a 约有二十二个核酸， 通常和其他把基因三瘪非翻译区结合，导致 rn 诱导的沉没复合体降解期把基因或阻碍期把基因的翻译。 随着小孩在复杂疾病中的研究深入，研究者发现在疾病的发生发展过程中，小孩也起着巨大的作用， 其功能异常，能够导致各种人类复杂疾病的发生。浙江时小孩研究可能成为疾病诊断愈后的新的生物学 标记，会进一步理解复杂疾病的发病基地，提供了新的手段。小 ln 是目前金主研究领域的研究热点。 小 ln 首次发现于一九九三年，是在对秀丽心小感线虫发育过程中的研究发现的，命名为 ln 四，通过与 ln 十四的三点 u d r 相互作用调节线虫的发育。 随后在县城果营害了细胞斑马鱼、人类、闽南界和水稻等多种综合模式生物中找到了上百个类似的小分子 lna， 并将其称为 mira。 下面我们来看一下小 la 系列的特点。 首先，小 lna 本身不具有排放阅读框、不编码蛋白质成熟的小 lna 五撇端为单一，临川集团三撇端为枪击。下面来看一下小 lna 表达的特点。 小 r a 区有识趣性以及组织特异性，在特定的时间组织才会表达小 r a 区。把基因是多对多的关系，一个小 r a 可能调控多个把基因， 一个金也可能受多个小 la 的调控。小 la 倾向于城处，出现在人身体上， 通常定于五十 k b 的距离为一处，并且在物种间高度保守。 下面我们来看一下小儿 a 的作用机制。小儿 a 能够起到意志和降解的作用，具体是哪种作用，取决于小儿 a 与其把基因种植区域的互补程度。 小 l a 结构上，通常小 l a 五撇端第二位到第八位的核干酸序列为种植区域。如果种植区域把基因两者完全互补，则起到降解作用。如果两者不完全互补，则起到抑制作用。 对于小 la 的分析，最好的方法就是在 la 提取后监控测距之前，通过凝胶电影筛选出长度在二十二 bp 左右的序列， 因为这些小片段就有可能是小孩。 为什么说可能是小孩 a 呢？因为这些短片段也可能是其他 ra 发生的降解，与正常的小孩 a 混在一起，所以样品一定不要降解。 对于一些组织特异性和低表达小儿人系列，用实验的方法将他们见面出来有时候会很困难，所以使用软件预测是一种很好的方法。可以使用 m r r sky 软件对于小儿人进行预测，不过这个软件只能在线使用。 主要我们还可以利用以下几个方法来做小行业的预测。 我们还是建议使用 rac 和车距的方法来鉴定小 la。 接下来我们来看一下小 la 把基因的预测方法。鉴定出小 la 之后，寻找小 la 作用的把基因非常重要。小 la 的把点通常分为两类，一种是五撇端主导型，另一种是三撇端补充型。 其中五撇端主导型又分为五撇端主导的标准型和种植型 甲而 a 的把基因预测要遵循一些基本原则，甲而 a 的种植区与把基因的三撇 utr 序列剪辑互补，把点在多物种间的序列保守性。 最后还要看小儿英语把基因形成双链结构的热力学稳定性。 你说的 基本步骤为，首先在三撇 utr 上寻找和小儿 a 种子去完全互补的序列，然后计算小儿 a 和这些序列结合产生自由能的下降值，对把点进行筛选。最后对把点进行物种间序列比对， 利用物种保守性做进一步的筛选。我们可以使用以下方法进行把金的预测。 此外还可以使用机器学习的方法，通过少量实验证实小 l a 把基因集合内提取小 l a 与把基因的结合特征，并利用这些特征训练分类器来预测小 l a 的把基因， 例如他给的 boss 和 mate gate 等。小 r a 版金预测算法都是基于积极学习开发的。 这些上法从实验验证的小儿 a 把基因集合出发，评估小儿 a 的把基因结合位点的序列特征。二、具体结构特征和日立学特征等参数。最后对预测的把基因进行打分。 此外，还可以使用数据库比对来鉴定小儿与把基因之间的关系，例如他被是数据库 mir 贝斯数据库，这个数据库集成了小儿人序列注册信息以及预测把基因数据库为一体的数据库，是目前存储小儿人信息 最主要的公共数据户之一，主要采用敏锐达算法预测。一、把基因 a r g。 数据库整合了小 r a 基因数据库，大盖词是库基因主注视库、顶帽门的是库以及位置关系可拉丝的库的综合数据库。把基因库中采用四种常用的把基因算法， 丹南、麦克鲁蒂、美瑞达、派克塔。他给了四个爱，对小 r 一把剑进行预测。 此外还有 rna 二十二数据库、 micro rna 点、 o r r g 数据库等。

要谈论高通量测序在血液肿瘤的作用呢，就得先说明他到底是什么。高通量测序又称为二代测序，主要是相对于传统的三个测序，也就是我们常说的一代测序而言的， 它主要是基于 pcr 和金芯片发展而来的一个技术。一直以来呢，一代测序是因可靠、准确和可以产生长的独长而被管放的应用。但是呢，它的致命的缺点就是非常慢，而且它的灵敏度较低。因此，虽然它是金标准，但是仍有较多的限制， 已经不能满足临床的研究需要。而二代测序呢，他可以利用大量的病情处理，读取多个短的 dna 片段，然后拼接成一副完整的图画。因此他能够从血液或者唾液中分析测定基因的全部序列，进而预测罹患多种疾病的可能性。那 那高通量测序到底有什么优点呢？第一个是通量高，它可以同时检测成百上千个基因突变。第二个呢，它具有很高的一个灵敏度，相对于一代测序是大于十倍以上。 第三个呢，它可以在多层面、多形式的变异上进行检测，主要包含哪些呢？碘突变差而缺失变异和金从排拷贝数变异等等。第四，它的成本较低。 二代测序相对一代测序来说，他大幅的降低了成本，保持了较高的一个准确性，并且他降低了测序的时间， 因此他在临床检测中具有良好的应用前景。进一步就会说，阿达测序他可以检测哪些临床项目呢？目前主要涵盖以下几个方面，全金组、全转路、全外和红金组以及靶向测序等五个方面。其中靶向测序呢，也就是我们 常说的拍弄测序，我们目前主要基于以路面的平台进行搭建，过程呢，包括 dna 的文库自备和上机测序两个步骤。其中呢，测序的过程，它是采取的边合成边测序的模式完成的，测序呢，经过声线分析后得到结果。 它的文库构建呢，主要是两种，一种是扩增法和补货法，一般来说扩增法的操作简单，然后对提取的 dna 的核酸完整性也相对较低，而且它耗时较短，对数据量的需求呢，也相对较小。 而补货法的呢，步骤较多，对于各个方面的，比如提取的金属呀，然后时间呢，以及数据的需求量均比较长，但是他的优点呢，他是对大片段的差而缺失的判读呢，就有一定的优势。 因此我们在设计的时候呢，会根据需要和检测的要求来选择合适的一个监控方法。记得点赞关注哦！

什么是 n g s 检测？ n g s 检测又叫做高通量二代测序，它是目前恶性肿瘤基因检测常用的一种方法， 他有什么优势呢？ ngs 检测流程是先将目的样本制备成为核酸文库，之后进行大规模的平行测序， 最后通过生物信息方法进行结果分析。从测序规模上说， n g s 可分为扩增产物测序、全外先子测序和全基因组测序。 扩增产物测序具有更深的覆盖度和更高的敏感性，尤其适合外周穴中低频突变的检测，目前广泛应用于临床。 全外仙子测序和全基因组测序虽然检测位点更多，但是测序深度和敏感性不如扩增产物测序，对测序样本的质量要求更高，费用高，目前更多应用于临床研究。

二代的高通量测序和三代的高通量测序的区别是什么？它读长的长度是不一样，我们人的基因三亿，对了，但是呢他不可能能把这一个检测三亿的就是从头读到尾的， 那么他就是分段分段的读，通俗理解成呢，这一条公路大概呢就是有十公里，但是我任何一个卷尺是一下子测不到，说能从零一次搞到 那个十公里的。那么我就说这个转尺大概是一米一侧，一米一侧，然后大家把它拼接在一起。二代和三代的区别是什么？这个卷尺的长度是不一样，二代他就是一次打开就这个读物 三百个 bp， 三代特区呢？他一下子呢都十 k， 赌的次数越少他越少。所以我们现在搞投降特区是短赌场，二代特区、三代特区是长度上刚刚才流行的特别特别过。

哈喽，大家好，通过上一节课学习以鲁米纳官方推出的测序原理视频，相信大家对测序原理有了一定的了解， 那么这节课呢，我主要给大家介绍一下语录，蜜蜡测序的三大关键技术，主要包括乔式屁大扩增，边合成边测序，还有一个根据颜色判读剪辑。 那学习之前呢，先来看一下真正的 flow sale 长什么样子，嗯，真正的 flow sale 呢，大概是一个窄拨片大小， 那么这个载拨片大小的 float sale 上被分成了八条烂，也就是八个通道，那么这些通道里呢，会有液体流来流去，所以叫 float sale。 接下来我们来介绍一下乔式 p t r 扩增。那么乔式 p t r 扩增呢，其实就是对 dna 片段进行复制， 解决荧光信号太弱的问题，通常复制几千个毫倍，那么这样就可以在测序芯片上形成 cluster， 达到放大荧光信号的作用。如果不进行乔式 pcr， 那么我们的单个片段只能添加一个点击，那么它的荧光信号太弱了， 我们的扫描仪就无法补货。那么接下来我来简单介绍一下乔式 p c r。 那么调试 pcr 的关键呢，就是我们测序的 dna 模板链上有两个不同的测序接头，这两个测序接头呢， 和 flowsell 上随机种着的两种 alec 序列呢，能够互补配对。我们的 dna 模板链呢，无论哪一头结合到 flowsell 上，都可以通过弯曲找到它周围的互补配对的 一个序列，这样的话就可以进行自我复制，形成 cluster， 最终达到放大荧光信号的作用。 cluster 虽然好可以放大荧光信号， 但是也会存在一个问题，就是 cluster 当中所有的 dna 片段模板的测序速度必须保持一致，也就是在一个循环当中，所有的片段必须同时添加上一个剪辑。一旦有一个或几个片段 没有添加上剪辑，那么这些掉队的定位片段在下一次循环当中就会影响整个 cluster 的荧光信号，久而久之荧光信号会变得越来越弱， 随着锐字长度的增加，测序错误率会越来越高。正是因为这个原因，乙路润亚的测序长度不会太长， 一般也就几百个 b p。 那么接下来我们来讲解一下边合成边测序加颜色判读剪辑。那么要实现边合成边测序呢，由鲁米拉公司对四种剪辑 a、 t、 c、 g 做了化学修饰， 主要的化学修饰呢包括两个方面，一个方面呢是对剪辑的三一撇端枪击处加了一个叠弹集团，防止添加了一个剪辑之后呢再添加上一个剪辑，也就是每次循环只能添加一个剪辑。 那么第二个修饰呢，就是在剪辑上标记了一个荧光集团，并且呢每一种剪辑呢标记了不同的荧光集团，那么不同的颜色呢代表不同的剪辑。每次循环就 后我们只能添加一个剪辑啊，添加完一个剪辑之后呢，我们就会拍一张照片，然后根据空间还有位置信息来判断这个点加上了哪一个剪辑。那么如果是蓝色的话，我们可以认为他添加了一个 t。 那么一个循环过后呢，然后通过一些特殊的化学试剂呢，我们可以把叠断集团，也就是阻断集团呢给还原成枪击，然后把荧光集团给促灭掉，这样的话就可以继续添加下一个剪辑， 那么添加完下一个剪辑，再拍一次照片，然后通过颜色呢判读添加上哪个剪辑，依次循环，这样的话每次添加一个剪辑，就可以判断哪个剪辑添加上， 达到边喝成边测序的目的。那么这个剪辑的具体化学修饰呢，在这里有一个示意图，也就是在剪辑的三一撇端枪击加了一个 block， 也就是谍战集团， 通过一些化学反应呢，我们就可以把它还原成相机，这样的话就可以继续连接下一个剪辑。而荧光集团呢，通过一个反应把把荧光集团错灭掉，这样就不会干扰下一个剪辑的荧光信号。

这节课程我们来介绍一下 ncbi 数据上传，在数据处理完成之后，一般发表文章需要公开数据，因此将数据上传 ncbi 是一项重要的工作。对于 ncbi 数据上传， ncbi 官网都有详细的说明文档， 但是上传的步骤过于繁琐，新用户第一次操作还是需要非常大的学习成本。 ncbi 上传数据最重要的是两点，第一点是填好正确的信息，第二点是数据格式一定要满足 ncbi 的要求。 那么接下来我们就为大家介绍一下如何来进行 ncbi 数据的上传。首先我们来看一下可以上传到 ncbi 的数据类型， 这里面列出了 ncbr 可以接受的数据类型以及支持的上传方法， 包括拼接好的金主完成图草图、转录组数据、高通量测序位置、金主变异数据以及单条测距数据等等类型。这些数据根据不同的数据类型上传到 ncbi 不同的数据库中， 例如金主信息上传到知音、 bugriphone 等数据库，转录组数据上传到 tsa 数据库，而车区锐志则上传到 sra 数据库。下面我们来介绍一下上传数据过程需要使用的工具， 上含的工具包括钢铁的和筛和印。如果是比较小的 数据，一种十六 s 设计数据、单调基因等可以使用半 k 的在线提交就行。这里面注意，刚给的也并不是所有小的数据都可以接受， 如果剪辑小于两百 bp 就不行，除非标明这些数据来自于外弦指，外弦指有可能小于两百 bp 或者 ncra 小 ra 等。 如果是 e s t 数据，需要使用 d b， e s， t， c， c， t， c s s 数据，需要使用 d b， z， s， s， c。 四头 sts 数据需要使用 dbsts， cston 都不能使用班级的系统。 赛克印并不是网页使用，而是安装到本地电脑的软件，所以功能更多，支持的数据类型也更多， 可以完成批量上传。还有一个数据转换的工具， tbl two a s n tbl two a s a 是命令行软件，用于把序列处置信息转化为点 sq 文件，这个文件在上传金主序列的时候是必须用到的。 在数据上传过程中需要填写很多的信息，最好提前把这些信息整理好。包括联系信息，例如上传者的姓名、工作单位、部门、单位地址、日期、电话号码、邮箱等。 序列信息包括物种名、样品名、样品描述、样品特性等。还有测序信息，例如测序平台、测序类型、 稳固大小等，其他的还包括发表文章的信息等，总之需要填很多的信息。 接下来还有一件重要的工作，就是要注册 ncbi 的账号，买 acbi， 获得账号和密码， 买这边用于管理上传后的数据，如果后面数据有更新，还需要使用同样的账号进行维护，所以要保证好。这个账号注册比较简单，和其他网上账号注册的类似，这里面就不介绍了。 在获得了账号之后，登录账号，我们就可以开始进行数据的上传工作了。首先我们来介绍一下上传金主数据， 刚刚到 ncba 上传页面，里面包含很多接收数据的数据库，根据 上传的数据类型进行选择。这里我们要上传金主文件，首先点击包围 pro， 再给他创建包围 progel 号和包围三拨号， 对某一个物种进行了金属车序，就是申请包围 pro 和包围上方号各一个，点击妙三文门诊。接下来就是需要填写各种信息， 经过几个步骤之后，最后点击萨博梅特。包一 pro 债务的创建成功，我们会得到一个包一 pro 债务的 id， 以 prg n a 字母为前缀，这个号码在后面会用到。第二步要做的就是获取 sbt 文件， 在汤普勒的报复页面填写一些信息，包括刚才得到的，包括在和 id 提交完了，就会生成一个以点 sbp 结尾的文件，汤普莱特点 svp， 将这个文件下载下来，接下来一个非常重要的工作就是使用 tbl two asn 产生 sqn 文件 还是科文文件，是上面还是 bp 文件，金主序列文件以及金主注视信息文件， tbl 的一个综合体，所以需要对这三个文件进行格式转换， 这个过程比较麻烦，容易出错。其中金主注视信息并不是必须的，也可以只上传金主序列还是 bt 文件，我们已经有了， 就是从 ncba 下载下来的化身文件，就是金主的拼接结果，后缀是点 f a， 点化肥或者点 f ic 等。 注意这里面有格式要求，金主文件序列中不能有 get， 每个文件不能超过一万条。 八十 a 序列，第一行是大于号开头，后面是描述信息，下面是序列信息，每一条序列长度不能超过八十个。制服 后车为 ppl 表格格式的金属注册文件，有固定的格式要求，这个文件比较麻烦， 此文件有五列，每列用泰国分割称为飞车。泰国这个文件是最为麻烦 一部。该文件必须包含编码基因的结构注视信息、非编码基因的结构注视信息和基因的功能注视信息等。 比如前面我们系列分析中的基因预测跟 cr 分析和基因功能出事，一旦做不好， ncbi 的工作人员就会发以迈偶反馈修改意见。对于飞车推广格式，需要注意以下几点。 首先，对每条序列的所有出任之前有一行额外的内容，例如 aj 十 w 的一 该行内容，后面所有出事都属于史高否一，一定不能遗漏飞车这个单词。飞车和史高否一 用空格来分割。每个飞车使用五行内容进行阐述，并分成两个部分。第一部分是飞车在序列上的结构信息，有三列，分别是该飞车的起始微点、结束微点和飞车名。而飞车在正义链上 折起指为点，以小于号结束为点。落在复印链上折起指为点，以大于号为结束为点， 让飞车为断裂的 cds 或者海审等信息。这有多行数据，但仅在其首行的第三列显示飞车的名字。 第二部分是飞车的功能处置信息， 使用第四到第五列 前面有三个推波键，第四列对应飞车的框里菲尔，第五列是匡尔菲尔的值，库尔菲尔就是对飞车的描述标签，如果有多个框里菲尔极其值，则用多行进行表述。 黑色和快乐肥标签的具体名称可以参考这个说明。 常用的飞车名有知音 mra、 cds、 f 三、五撇、 utr、 三撇、 utr、 tra、 rincra 等。 其中 a 三 r a 是指除了 t， r a 和 r a 以外的其余 c r a 基因的高尔夫标签，一般是基因。 第五列使用金主系统化的金 id， mr 和 cds 的 coutuber 标签一般使用 pro。 第五列是安儿注视的结果。 f 三的 colower 一般使用 mate， 例如一二三的有 tr 的框里边标签使用 nott。 第五列是相应的 rv 种类。 ncra 的括列篇标签必须有 ncra plus。 第五列则是 ncra 的类别，比如 mara， sra， scra 等，主要可以使用 nott 作为框里边的标签，即使可以随意标示 m， r a 和 cds 的朋友大额取持使用安儿注视的最终结果。 这三个准备 好了之后，就可以运行 ppl two as 生成 sk 文文件了。运行程序结束之后，会生成以序列 id 命名的三个文件，分别以点 sk 文、点 v a， l 和点 love 结尾。 其中点 sk 文件就是我们最后需要的文件。点 vl 文件可以查看转换过程是否出现问题，而点 logo 文件则用来监视转换的过程。一般来说，点 vl 文件大小为零，这转换过程没有问题，否则需要根据 报出信息进行修改。另外我们还需要一个 aj p 文件，这个文件主要是列出每条 catel 的信息，包括起始和中指位置。 app 文件只需要 要写一个简单程序就可以统计，并不是特别难。那么经过以上步骤之后，现在我们就可以使用频道 macose 的上传点 sk 文件，登录频道 marpods 网页 最下方输入框中填写信息，然后上传点 sk 文和 acp 文件。如果有符合 acbi 注视标准的注视文件也可以一起上传，不过生成满足 acbi 格式要求的文件非常麻烦。 接下来再填写上传的信息，最后点击沙巴梅特数据就上传完成了。 这一数据上传到 三 a 数据库比金主要容易一些，大家可以查看相应的说明文档即可。本次课程只是做一个简单的介绍， ncbi 也会不断修改上传数据的方式，具体执行过程中也可能与本课程介绍的稍有不同。 建议大家在上传数据之前请仔细阅读说明文档。

so i'll be giving an introduction to high throughput sequence data and understanding the origin and shape of the data and what i mean by the origin is just where we're starting from and the shape of the data just in terms of like what file formats we're gonna end up with and how the data is structured so in general， we want to move from some biological sample represented by these test tubes to a list of variance and so we have multi steps process where we're going to prepare our biological samples then we're going to sequence them that's going to provide us with some pile of reeds in a number of files we're going to take these files and put them through the to cape best practices and that will produce a list of variance which is usually the thing that's of interest to us so the first thing that we have to do is what we call library prep and this is where we take our biological sample in this case some individual and we're going to extract either dna or rna from this individual and because sequencers can only at least aluminum sequencers can only sequence dna if we take rna out， we have to convert it into dna through a process called reverse transcript ace pcr， but once we have our dna we can go through a process of that we simply label is purifying fragments but this is going to be very dependent on what your application is so this will often involve like some amount of pcr maybe some sort of hybrids selection it could also involve a size selection of your fragments so once you have your collection of fragments you can attach adapters to these dna fragments so you have these double stranded dna fragments that now get these adapters that are ligated to both ends of the dna and the adapters are also made out of dna you can if you depending on the concentration of your dna you may need to pcr it up， so that you can increase your concentration， so， and then we call this a library once， we have built our library we want to sequence it， so we have our dna libraries in these test tubes we now need to put them on this flow cell a flow cell is an interesting device it's about it looks a bit like a microscope slide some of them are about the size of a microscope slide and while others are about this big a little bit bigger the flow cell is a device that has these ports where you put the content of your dna library on and it flows across this lane and the bottom surface of the flow cell is chemically modified so that the dna will bind to the bottom of the surface in such a way that there are patches that many different copies of that same molecule you'll get a single molecule that will land on one of these patches that will then amplify that particular strand of dna so that a single patch will now have many copies of that same strand of dna and you have roughly a billion to ten billion in different patches on the entire flow cell and this once you have these patches of dna we flow nucleotides across this flow cell in such a way that base pairs are added one base at a time and they're added with a die so that these patches each now have a color depending on what what dna base was is on the sequence that's attached to the bottom of close hole and so when you image it at each step you can see each one of these patches has a particular color and each color corresponds to a particular base and then this will result in what we call an enormous pile of short reads and by enormous we typically mean for each flow cell is going to be about ten or one billion to a billion or ten billion reads in the case of the noble seek as many as twenty billion， the raw sequences are typically provided in a format called fast q fast q is just a text format you can read it with a text editor like sublime， but these are typically very large files so that it's not recommended that you open them with sublime the format is of a single read we'll start with this app character and then the name of the name of your read the name of the read will oftentimes contain information like the name of the the barcode of the particular flow cell it may include information about which lane of the flow cell it was sequenced on and it may even provide some sort of xy coordinate about where exactly on the lane that particular reed was sequenced the contents of the reed is course here and then after this you can get this series of characters where each character represents the quality of the base and so this is so whenever the sequencer looks at a makes a base call it also makes a guess as to how confident it is each one of these characters represents some fred scale quantity and a fred scale quantity is just a log quantity of the probability of an error it's a nice scale so a fred scale of ten means that you're ninety percent confident fred scale of twenty means that you're ninety nine percent confident and of course and with each increase of ten in the fred scale， you're adding another nine to your confidence and here we just have a little plot of the accuracies and errors for each fred scale and so generally when you do raw sequencing on an aluminum sequencer we consider q twenties so things that are ninety nine percent confidence to be a good base call something that would be a q thirty would be very good and a q forty would be great and we do see that range it's also important to know whether or not you're going to be sequencing say hold genome or xo， the different types of data have different features that are important to keep in mind when you're doing your analysis so here this is just a a reference that we have some entergenic region， some exons and some intron between our exons and here each red line represents a reed that has come off the sequencer the red lines that have a star in them represent reeds that have a difference at that particular site and these differences here are indicative of a variant in practice this is what this looks like an igv so each reed is one of these gray rectangles with a little arrow at the end grey rectangle indicates that its matches the reference that is here on the bottom we're zoomed fairly far out here so we can only see colors each color represents a different base and because we're zoomed out so far we can't actually write each there's not enough room to print like an atc or g here we see a coverage track and this coverage track has a maximum value of fifty eight so you can see that there's some difference maybe almost of a factor of two across this whole region we can't see the entire depth here because this is a screenshot and you would be able to within igv you would be able to scroll down to see all of these reeds there are a couple key features to notice one is that each one of these reads has a direction and that's because each read is sequenced from five prime to three prime and depending on what which strand you grabbed of the double stranded molecule depends on which direction it's going to map to the reference in it each a lot many of these reeds also have some differences that are represented by various colors and these are differences from the reference most of these differences are sequencing errors and so we believe from experience that things like this here and here are likely due to some sort of failure of the sequencer to guess the correct base， but there are other differences like here that from experience leads us to believe that this is an actual biological variant here we're looking at a human sample and you'll notice that about half of these reeds have this difference and the reason why that's important is because humans are deployed and so half the reeds came from one chromosome and half the other chromosome and it turns out that one of these chromosomes had the difference in it we can't label each read as having come from a particular chromosome and so there's no sorted order here we don't know that all these came from maybe the paternal habitat or the maternal habitat so these may come in any order and you'll notice that there's another variant down here and you'll notice that they're in a different order from these likewise there's an yet another variant this here is an insertion and this insertion means that there are extra bases that don't match the reference and within igv if you want to look at those extra bases you can hover over this eye another feature that's important to look at is this coverage track between whole genome and xom you'll notice that the coverage tracks very widely here is this targeted region within the xom and we get very high depths over a hundred in the regions where we targeted， but there are some flanking regions where we get lower depths over nearby but non targeted regions even though we could see we do see this？ we do even though we do see evidence of a variant here we would have never be able to call it because we wouldn't be able to distinguish this between distinguished between this being a biological variant or some sort of sequencing artifact yes， there's a question for distinguishing between spitzing errors and variance is that just kind of a matter of looking at the proportion of reeds that a change shows up in and kind of throwing out the ones that only appear in a very small fraction of the reeds that in general yes， so， there are a number of statistical tests that are run when in the jtk， which you'll learn later and these statistical tests basically look to make sure that they look to see what is the probability of sort of roughly speaking what is a probability that this was caused by sequencing errors or biological variant and if the evidence strongly suggests a biological variant then the caller will make a variant call in the internet why do they not have a sharp boundary？ so， there are some xm capture some targeted pcr methods that do have sharp boundaries one of them is called amplikon sequencing， but most， but there is another process called hybrid selection which is what this is and hybrid selection you design baits that are complementary to this region of interest they don't have to grab that region perfectly they can grab a region that nearby and get something that's close enough and so they bind less efficiently which is why you see fewer of them but you still will get some so depending on what kit you use we just described this one as kit a and kit b you may get two wildly different coverages over slightly different regions so for example this kit for whatever reason appears to target this interonic region while this kit appears to target the exonic region and so depending on your application you may want to prefer kit over kit b quality control is essential when sequencing is expensive and so you want to catch your errors as early as possible there are a lot of common problems one is that you didn't do enough coverage or you didn't do enough another problem is that you may end up with a high proportion of chimerism so in alumina sequencing these are paired end sequences so you end up with each fragment has two reads and one read may map to one part of the genome while another read may map to a very disparate part of the genome and we call these and they're not always indicative of a problem because they do occur in structural variants， but there are sometimes library prep things that can go wrong during library prep that can result in high proportion of chimerism another problem that we sometimes see is like a strange insurance distribution having one that's too large or too small can indicate that something went wrong during library prep also additional peaks and places where you don't expect them can also indicate various problems when we do shearing so that we can get fragments of the appropriate size the shearing is a relatively violent process where acoustic waves are focused onto the dna and these acoustic waves can actually cause some of the bases to oxidize and when that happens that can result in either subsequent stages of pcr to go wrong or if these oxidized basis show up on the sequencer that can also produce incorrect results another problem that you might have is that you may have a library size that's too small this could be a result of this is usually the result of having a concentration of dna in your sample that was too low and you can do a lot of sequencing， but if you do a lot of sequencing with a library size that's too small many of your molecules will be duplicates of each other and those duplicates don't provide any additional information about the biology and so you're spending a lot of money unnecessarily so two common differences that we see between say xms and genomes is that with an xm there's a very significant on evenness in the distribution of coverage one metric that we use for measuring how uneven coverage is is something called fold eighty fold eighty is just the measure of how much extra sequencing we would have to do to bring up the average target to the mean target coverage of that particular target another thing that can happen is that you can get reference bias， the baits are designed you typically to capture the reference if there is a variant in your dna the baits will bind less efficiently to that dna and so you can end up getting a larger number of reads that have the reference base than you expect by chance with whole genomes sometimes you will get a much higher proportion of unmapped reads that's okay sometimes when you're sequencing everything maybe not everything is going to align well to the human genomes that could be because you may have bacteria in your sample or other contaminants and it can also be because there are other contexts that are just not represented in the reference and another problem that we sometimes see is that we can get a high percentage of adapter in our reads there are a number of error modes that are common and that can interfere with our high quality data generation one of these one common problem is regions of the genome that are high in gc content gc rich areas are problematic because these gc base pairs have three hydrogen bonds and that rather than two which the at base pairs have and that results in these molecules with high gc content having a higher melting temperature and so sometimes they don't always disassociate from each other and so they can be more difficult to sequence and so here you can see that in regions of the genome that have lower gc content we see a decent number of reeds， but with a particular kit we lost a lot of reeds in this high gc content region the distribution of your coverage matters if your different kits will have different coverage distributions you may have and just depending on what your application is one kit may be preferable to another um so if you have uneven coverage one thing that can happen too is it can inflate your it can give you if you have a high depth in an uneven territory it can give you a nice mean coverage and so sometimes looking at just mean coverage is not enough you want to look at other metrics that like the foldating metric that indicate how even your targets are or how evenly your sample is covered we even see unevenness and coverage between reed groups i think this is a little bit less common than what we see in between say axo magina， but different reed groups for various reasons may have different coverage and so， and sometimes they don't have enough coverage so sometimes we want to sequence additional read groups so that we can combine the two results to increase our coverage if the first run wasn't enough would you say very group to his problematic and previously just so you would not use the well， i think that that's very dependent on your application i think that it's actually okay to use to add this because it may have failed in the sense that it has very low coverage， but it can be i think in generally it can be added if it were being used as a top up， so how do you define a recoup is it like a replicate of a sample you run in the different lane or the same lane again it would be in a different lane sometimes we also see high percentages of cymerism usually when you see reeds that have bright colors in igv like this that's an indication of some sort of problem each one of these colors means something different depending on the particular options that you have set in igv， and so you can't always remember what these colors correspond to and so in this particular case the colors indicate that the reeds are mapped to a different contag that's a indication of various problems that could have occurred during library prep， but it's also something that you can see when it's not uncommon to see chimeras in regions of structural variance， but if you can get your chimeric rate down so， if you have a really high concentration of chimeras， when you your other metric are affected， so for example here we have a high amount of chimeras and a a relatively low percent selected bases and so if we can reduce our chimeric rate that'll increase our percent selected， and it can also increase our percent of targeted bases at twenty ex， so if it's considered primary because it maps to a different location in the reference， why does idv show it here because it's part of the pair no yeah， because it's part of a pair so this read may be read one while read two may be really far away either on the same chromosome or on another chromosome it's also important to look at insert size distributions it's depending on the particular protocols that you're using you may have multiple peaks， but it's important to know when you have a peak that's abnormal as here we noticed a very abnormal peak in some data that was sequenced with immune compromised individuals where the samples were taken from saliva and these saliva samples had very high concentrations of bacteria and the bacteria had enough similarities to the human reference in places that they managed to align to the human reference creating these gigantic coverage peaks at various places， these rainbow like areas are regions where the reed doesn't match the reference and what's happening is we call these soft clip bases and these are regions where the a liner has given up and says i don't know something funny happened， but these reeds are all most of these reeds here are bad and you can notice apps through here so just to recap we're going from a biological sample， all the way through sequencing and processing to generate a lift of variance。